Научный проект: что уже сделано?

Больше года назад мы рассказывали о старте нового масштабного диагностического проекта, в реализации которого врачам и ученым помогает фонд «Подари жизнь». Речь идет о проекте «Молекулярная диагностика и мониторинг острого лимфобластного лейкоза у детей». Проект охватывает тысячи детей, которые лечатся от острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ, самого распространенного детского онкологического заболевания) в соответствии с отечественным протоколом «Москва-Берлин». И сейчас в него уже включены пациенты 44 клиник.

Александр Карачунский, руководитель группы по лечению ОЛЛ «Москва-Берлин»
Александр Карачунский, руководитель группы по лечению ОЛЛ «Москва-Берлин»

Речь идет как о постановке точного подробного диагноза каждому ребенку, так и о контроле над течением болезни и эффективностью лечения. Действительно, жизненно важна и первичная диагностика (ведь от молекулярного варианта болезни зависит назначение оптимальной терапии), и мониторинг (который помогает вовремя сменить подход к лечению, подключить новые лекарства и новые стратегии).

Но не менее важно и другое: централизованный сбор данных помогает их систематизировать и анализировать. Ведь существует много вариантов ОЛЛ, и, хотя эта болезнь активно изучается уже десятки лет, про нее пока еще не всё известно. Нужно продолжать исследования: разбираться, какие характеристики «больных» клеток важны для назначения дополнительных лекарств (мы уже знаем несколько таких характеристик, но ведь их наверняка больше!), какие позволяют сразу предсказать, что течение болезни может быть неблагоприятным и с большой вероятностью потребуется трансплантация костного мозга (опять-таки, кое-что мы знаем, но этого недостаточно).

То есть фактически речь идет о том, чтобы двигать вперед медицинскую науку, медицинские технологии.

От этого зависит не только судьбы тех, кто лечится от лейкоза сейчас, но и эффективность лечения в будущем: через пять, семь, десять лет. Детский ОЛЛ сейчас считается хорошо излечимым заболеванием, но пока еще не все задачи решены: 10-15% заболевших детей не удается спасти, да и некоторые из вылечившихся потом годами борются с осложнениями тяжелого лечения… Словом, задача разработки более эффективных персонализированных подходов остается актуальной, и молекулярная диагностика играет тут первостепенную роль.

Основные этапы

Михаил Масчан, один из руководителей программы лабораторной диагностики
Михаил Масчан, один из руководителей программы лабораторной диагностики

Проект реализуется на базе Центра детской гематологии им. Дмитрия Рогачева, куда присылаются биообразцы из региональных клиник со всех концов России. Серьезный вклад в реализацию научного проекта вносят и лаборатории ОДКБ г. Екатеринбурга, где проводятся необходимые исследования для пациентов целого ряда клиник из различных регионов Урала и Сибири.

В рамках проекта проводятся анализы двух основных типов. Первый — иммунофенотипирование с использованием метода проточной цитометрии. Это основной анализ в диагностике острых лейкозов. И второй тип исследований — генетические анализы, позволяющие узнать особенности ДНК опухолевых клеток. Именно результаты таких иммунных и генетических анализов позволяют как устанавливать точный вариант болезни, так и отслеживать уровень минимальной остаточной болезни и своевременно обнаруживать рецидив или угрозу рецидива.

Научный проект рассчитан на три года. Но уже сейчас, когда приближается его экватор, можно понемногу подводить первые, предварительные итоги. Итак, что же сделано?

Сначала немного цифр. За девять месяцев 2019 года (с апреля по декабрь) в Центре Рогачева проведено 5351 исследование: 2655 иммунных (проточная цитометрия) и 2696 генетических. Всего обращения по поводу анализов с целью первичной диагностики или мониторинга поступили от лечащих врачей 1492 пациентов — естественно, многим из них те или иные исследования проводились неоднократно. Далее, за первое полугодие 2020 года лаборатории Центра детской гематологии провели 2997 исследований (1217 иммунных, 1780 генетических), а обращения поступили от врачей 1126 пациентов.

Кроме того, уже получены некоторые научные результаты или создан задел для их получения в будущем.

Иммунодиагностика

Как уже было сказано выше, иммунофенотипирование с помощью проточной цитометрии является золотым стандартом диагностики острых лейкозов. Речь идет о сортировке и подсчете разных типов лейкоцитов согласно определенным «маркерным» белкам на их поверхности. Врачи и ученые уже давно научились интерпретировать эти результаты. На их основе можно отличать ОЛЛ от других вариантов лейкозов, определять его «линейность» (то есть из В- или Т-клеток развился ОЛЛ) и степень зрелости опухолевых клеток. А это, естественно, влияет на терапию. Конечно, само по себе иммунофенотипирование никак не является новым методом, но в научном проекте речь идет о совершенствовании его применения в рамках протокола «Москва-Берлин».

Примеры результатов проточной цитометрии при В- (сверху) и Т-клеточном (снизу) ОЛЛ
Примеры результатов проточной цитометрии при В- (сверху) и Т-клеточном (снизу) ОЛЛ

За время работы этого проекта в лаборатории иммунофенотипирования Центра Рогачева сформированы стандартизированные наборы реактивов для ключевых исследований. Как сообщает заведующий лабораторией А.М. Попов, «был разработан, протестирован и внедрен готовый набор из 10 антител, позволяющий точно определять, есть ли в образце костного мозга опухолевые клетки, а также их линейную направленность.

 Стандартизованный готовый набор антител позволяет унифицировать алгоритмы анализа, а также получить крайне воспроизводимый и точный диагностический метод.

Кроме того, готовые наборы реагентов были разработаны, протестированы и внедрены и для решения других задач, включая определение минимальной остаточной болезни». А использование стандартизированных наборов реактивов — это не только быстрота и эффективность, но и минимизация риска ошибки.

Кроме того, были разработаны диагностические рекомендации для некоторых редких вариантов ОЛЛ, а также для тех случаев лейкоза, которые можно спутать с лимфомой Беркитта — болезнью, которую лечат совершенно по-другому. Исследовался ряд поверхностных маркеров опухолевых клеток, которые могут служить мишенью для новейших таргетных лекарств. Изучены некоторые другие клеточные маркеры; в частности, удалось установить, что обнаружение некоторых из них влияет на стратегию последующих молекулярно-генетических исследований для проведения максимально точной диагностики и назначения терапии. Начато подробное изучение и других вариантов болезни — в частности, при Т-клеточных лейкозах.

Генетические исследования

Известен целый ряд генетический аномалий опухолевых клеток, которые сильно влияют на терапию и прогноз ОЛЛ. В частности, в мировой детской гематологии хорошо изучено значение нескольких транслокаций, при которых фрагменты двух хромосом меняются местами. Какие-то транслокации требуют добавления к терапии дополнительных лекарств, какие-то указывают на то, что почти наверняка потребуется трансплантация костного мозга. Но клиническое значение многих других генетических изменений, встречающихся при ОЛЛ, пока не полностью ясно. А ведь оно могло бы быть важным для оценки возможной эффективности лечения. Так что в ходе реализации научного проекта проводятся цитогенетические и молекулярно-генетические исследования целого ряда аномалий.

При этом сразу было понятно, что в этих исследованиях должны быть выделены два направления: изучение В- и Т-клеточных ОЛЛ, то есть случаев острого лимфобластного лейкоза, возникших из предшественников В- или Т-лимфоцитов.

Ю.В. Ольшанская
Ю.В. Ольшанская
Про В-клеточные лейкозы (а это подавляющее большинство всех случаев ОЛЛ) к настоящему времени известно довольно много. Тем не менее, если убрать из рассмотрения все хорошо изученные генетические варианты, остается довольно большая группа «других» В-клеточных лейкозов (B-other), которые различаются и по своим генетическим особенностям, и по частоте рецидивов. Среди генетических особенностей важны как числа копий некоторых генов и их фрагментов (copy number variations, CNVs), так и точечные мутации в генах (single nucleotide variations, SNVs), а также комбинации различных изменений. Какие-то исследования уже были начаты за рубежом, но их результаты пока еще далеко не полны, и сотрудники лаборатории цитогенетики и молекулярной генетики Центра Рогачева (заведующая — Ю.В. Ольшанская) начали собственные исследования влияния числа копий (CNV) на выживаемость пациентов. На первом этапе проводится в основном сбор данных; по его завершении можно будет говорить о результатах их анализа. Кроме того, анализируются мутации отдельных генов (SNV), которые могут влиять не только на течение болезни, но и на чувствительность к различным лекарственным препаратам и на их переносимость. Разработаны методики, начаты сбор и анализ данных, и впоследствии предполагается использовать эти результаты для уточнения прогноза развития болезни и разбиения на группы риска в рамках протокола «Москва — Берлин». Кроме того, в 2020 году должен быть внедрен обязательный мониторинг минимальной остаточной болезни для многочисленных генетических вариантов ОЛЛ с повышенным риском рецидива.

Другое важное направление — изучение Т-клеточных лейкозов. Они составляют лишь около 15% всех случаев ОЛЛ, но их лечение до сих пор представляет более сложную проблему: в частности, рецидивы Т-клеточных лейкозов особенно трудно поддаются терапии. Генетические изменения как при первичном Т-клеточном ОЛЛ, так и при рецидивах бывают самыми разнообразными, и обнаружение некоторых мутаций может дать новое понимание развития болезни и критерии для оценки возможной эффективности химиотерапии. Поэтому и в этом направлении сейчас активно применяются современные методы генетического анализа и ведется сбор данных — особенно касающихся частоты развития рецидивов.

Минимальная остаточная болезнь

В онкогематологии существует понятие минимальной остаточной болезни. После проведения химиотерапии или на каком-то ее этапе бывает так, что клинических признаков лейкоза уже нет, но в организме еще остаются небольшие количества опухолевых клеток, которые можно обнаружить самыми чувствительными анализами. А это означает, что болезнь с большой вероятностью может вернуться…

Именно поэтому мониторинг минимальной остаточной болезни (с использованием как проточной цитометрии, так и генетических методов) — задача не менее важная, чем определение особенностей болезни при постановке диагноза. Ведь именно этот мониторинг позволяет своевременно корректировать терапию — а значит, улучшать результаты лечения.

Так, плановое определение минимальной остаточной болезни у всех пациентов по окончании первого этапа терапии ОЛЛ сразу позволяет выделить тех детей, которым, скорее всего, потребуется трансплантация, даже если формально у них зафиксирована ремиссия (исчезновение признаков болезни). Если у больного долго сохраняется минимальная остаточная болезнь, этот может быть поводом применить дополнительные лекарства, иногда даже экспериментальную терапию. Если у больного был длительный перерыв в терапии по той или иной причине, именно мониторинг минимальной остаточной болезни позволяет выбрать наилучшую стратегию дальнейшего лечения — кому-то можно продолжать стандартную терапию, кому-то надо повысить ее интенсивность. А бывает, что тщательное исследование минимальной остаточной болезни позволяет и улучшить прогноз: скажем, у ряда детей на определенных этапах лечения порой возникают изменения в анализах, которые без дополнительных уточнений могли бы рассматриваться как рецидив лейкоза, а на самом деле являются просто результатом восстановления нормального кроветворения.

Также важное значение имеет измерение минимальной остаточной болезни перед трансплантацией костного мозга. Наличие минимальной остаточной болезни значимо повышает риск рецидива лейкоза даже после трансплантации, и необходимо дополнительное применение методов иммунотерапии, чтобы повысить шансы на успех и все-таки спасти этих детей. И убедительные результаты, достигнутые в НМИЦ ДГОИ, уже опубликованы.

Итоги трансплантации в зависимости от минимальной остаточной болезни. Публикация: Blood, 2019, 134, supp. 1, 4618
Итоги трансплантации в зависимости от минимальной остаточной болезни. Публикация: Blood, 2019, 134, supp. 1, 4618

Разумеется, исследования минимальной остаточной болезни, как и другие исследования в рамках научного проекта, позволяют не только улучшить лечение отдельных детей сейчас, но и накопить достаточно данных для анализа, результаты которого приведут к будущему улучшению результатов лечения.

Работа продолжается.